Плазмиды PDF Печать E-mail

Для того чтобы молекула чужеродной ДНК не терялась при делении клеток, она либо должна быть встроена в ДНК клетки, либо должна содержать специальные последовательности, которые обеспечивают ее правильное удвоение и расхождение в обе дочерние клетки при делении. Такие последовательности называют "векторами". Наиболее распространенными векторами являются плазмиды.

Плазмиды представляют собой кольцевые двуцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких тысяч пар нуклеотидов. Каждая бактерия, помимо основной молекулы ДНК кольцевой формы размером около 5x106 пар нуклеотидов, может содержать несколько различных плазмид. Они содержат регуляторные участки, которые позволяют им удваиваться независимо от репликации бактериальной ДНК.
Плазмиды несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены устойчивости к различным факторам: например, лекарственным препаратам (антибиотики) или тяжелым металлам. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к различным факторам. Бактерии могут довольно легко обмениваться плазмидами друг с другом.

Устойчивость к антибиотикам, которую плазмида придает бактериальной клетке, значительно упрощает отбор тех бактерий, в которые внедрилась плазмида. Так, у нас есть плазмида, несущая устойчивость к ампициллину. Соединяем ее с геном нужного нам белка и вносим в суспензию бактерий. Бактерии высеваем на питательную среду, содержащую ампициллин. Те бактериальные клетки, которые не содержат плазмиду, погибают. Остаются только те, которые получили плазмиду-вектор. Они размножаются на питательной среде, и вместе с ними происходит размножение плазмиды со встроенной ДНК. Говорят, что идет клонирование рекомбинантной ДНК.

Кодирующую последовательность ДНК либо создают искусственным образом, основываясь на последовательности аминокислот в полипептиде, либо синтезируют с помощью обратной транскриптазы на молекуле иРНК, либо выделяют соответствующий ген из клеточной ДНК.

Чаще всего процесс поиска гена начинается с конструирования "библиотеки ДНК". Для получения библиотеки суммарную ДНК клетки фрагментируют и клонируют в плазмидах или фагах. Если при этом мы получили достаточно много клонов, содержащих разные фрагменты ДНК, то мы можем надеяться, что для любого гена клетки найдется клон его содержащий. Такая библиотека называется представительной. Представительная библиотека ДНК человека должна содержать не менее 1500000 независимых клонов. Среди полученных клонов с помощью гибридизации отыскивают тот, который содержит ДНК, кодирующую нужный нам белок.

Для проведения реакции гибридизации необходимо иметь одноцепочечную молекулу ДНК, комплементарную части структурного гена и содержащую радиоактивные изотопы. Кроме того, нужно иметь отпечатки колоний бактерий, полученные методом реплик. Эти отпечатки наносятся на специальную бумагу, удерживающую бактерий. Затем ее обрабатывают таким образом, чтобы вызвать гибель бактерий и денатурацию их ДНК, и наносят на нее раствор комплементарной ДНК с радиоактивной меткой. В тех местах, где происходит гибридизация, на специальном приборе обнаруживается повышенное радиоактивное излучение. Именно эти клоны бактерий оставляют для дальнейшего размножения и получения нужного количества гибридной ДНК.
Простота устройства плазмид и легкость, с которой они "входят и выходят" из бактерий, используется генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов. Кроме плазмид, в качестве векторов используют ДНК фагов, вирусов и др.
Выбор вектора зависит от целей, которые преследует внедрение чужеродной ДНК.

Для внедрения чужеродной ДНК в клетки эукариот требуются более сложные методы. Например, используют химические вещества, нарушающие целостность плазматической мембраны, либо “обстреливают” клетки мельчайшими металлическими шариками, покрытыми молекулами ДНК, и т.д.
Перенос генов в бактериальные клетки дал уникальную возможность получения редких белков человека в промышленных масштабах. Так, с начала 80-х гг. из бактерии Escherichia coli получают такие белки, как соматотропин (гормон роста), интерферон и инсулин, который необходим для лечения некоторых форм сахарного диабета.

Сахарным диабетом страдают несколько миллионов людей на Земле. Инсулин для их лечения раньше получали из органов животных. Однако у многих пациентов такой инсулин вызывал резкую иммунологическую реакцию и приводил к отягощению состояния здоровья. В настоящее время инсулин производится генно-инженерными методами.

Ген инсулина человека содержит информацию о последовательности 108 аминокислот. Выделяемый в кровь зрелый инсулин состоит из двух полипептидных цепей, 21 и 30 аминокислот, соединенных дисульфидными связями. Созревание белка происходит постепенно. Вначале отрезаются 24 аминокислотных остатка на N-конце молекулы. Они служат сигналом для синтеза полипептида на мембране ЭПС. В цистернах аппарата Гольджи происходит вырезание последовательности из 33 аминокислотных остатков (С), она необходима для правильного образования дисульфидных мостиков. Понятно, что процессы созревания белка в прокариотической клетке происходить не могут. Поэтому, для бактериального производства инсулина были вначале синтезированы химическим способом две последовательности А и В. Затем их встроили в структурный ген плазмиды, внедрили в клетки E. coli. Белки были синтезированы. Из них вырезали последовательности А и В, затем химически инициировали образование между ними дисульфидных связей. Такой сконструированный инсулин ничем не отличался от инсулина, синтезируемого клетками человека.

Выяснение точной последовательности нуклеотидов в гене является одним из важнейших этапов его изучения. Процесс определения первичной структуры гена называется секвенированием.

Принцип одного из методов секвенирования объясним на следующем примере. Допустим, что у нас имеется нуклеотидная последовательность из 10 нуклеотидов. Мы присоединяем радиоактивную метку к нуклеотиду, находящемуся на 5-конце. Затем делим раствор ДНК на четыре пробирки. В каждой пробирке проводим специфическую реакцию, которая разрывает ДНК после определенного нуклеотида. Далее проводим электрофоретическое разделение фрагментов из каждой пробирки и сопоставляем размеры фрагментов, содержащих радиоактивную метку. С помощью такого метода можно “прочитать” в одном эксперименте последовательность из нескольких сотен нуклеотидов.
К началу 2000 года установлены нуклеотидные последовательности ДНК многих вирусов и бактерий, пекарских дрожжей, одного из вида круглых червей. К концу 2001 года практически “прочитана” вся ДНК человека. Ее анализ
позволит понять молекулярные основы возникновения болезней человека и целенаправленно искать способы их лечения.

Интересные статьи по биологии:

1) Молекулярные основы жизни

2) Образование первых органических соединений