Роль искусственных хромосом дрожжей в изучении генома человека PDF Печать E-mail

Прочтение генетического кода генома человека стало центральной проблемой молекулярной биологии и генетики в конце 80-х годов. Национальные программы "Геном человека" были приняты во всех странах с развитой наукой, в том числе и в бывшем Советском Союзе. В итоге за 10 лет интенсивной работы мирового сообщества на рубеже третьего тысячелетия вчерне расшифрована нуклеотидная последовательность генома человека, созданы физические карты каждой из 23 хромосом, идентифицированы гены, ответственные за многие наследственные заболевания.

Полностью завершено секвенирование более десятка геномов микроорганизмов, растений, низших и высших эукариот. Возникли новые науки — геномика и протеоми-ка. Успехи в этих областях во многом обусловлены возможностью клонировать ДНК в искусственных хромосомах дрожжей (YAC).

Лаборатория молекулярной генетики дрожжей ИМГ РАН — единственный отечественный научный коллектив, который освоил и применяет прецизионную и трудоемкую технику конструирования УАС-клонотек с последующим скринингом УАС-клонов, их анализом и характеристикой, а также определение генетического контроля поддержания YAC в клетках дрожжей.

В рамках всесоюзной, а позднее всероссийской программы "Геном человека" нами были получены и охарактеризованы в 1991-х годах УАС-клоно-теки ДНК дрозофилы и лимфоцитов человека для поиска протяженных не-сателлитных повторяющихся последовательностей рДНК генов.
Частичная библиотека генома D. melanogaster содержала УАС-клоны, размер которых от 90 до 500 т. п. н. определен при сравнении их с молекулярной массой природных хромосом, фракционируемых методом электрофореза в пульсирующем поле, с последующей визуализацией окраской бромистым этидием и ДНК-ДНК-гибридизацией. В соавторстве с сотрудниками лаборатории чл.-корр. РАН В. А. Гвоздева УАС-клоны были генетически картированы методом гибридизации in situ с политенными хромосомами слюнных желез личинок дрозофилы. Помимо клонов, локализующихся только в единственном сайте эухроматина, получены клоны с повторяющимися последовательностями из районов прицентромерного бета-гетерохроматина.

Анализ первичной структуры одного из УАС-клонов с гетерохроматичной ДНК Х-хромосомы дрозофилы выявил две последовательности, которые представили интерес для дальнейших исследований. Одна из них — тандем вовлеченных в процесс сперматогенеза генов Stellate, структура и функции которых в то время были мало изучены, а другая — последовательность псевдогена 18S рРНК вне известного ранее кластера 18S рДНК. Вопреки общепринятому мнению о том, что копии повторов, кодирующих 18S рРНК, идентичны, были получены результаты о существовании в геноме вариантов 18S рДНК генов и о возможности рекомбинации между ними. Этот факт свидетельствует о внутригеномной дивергенции и эволюции последовательностей рДНК. Таким образом, результаты молекулярного анализа гетерохроматических районов, которые включают утратившие свои функции элементы — псевдогены, могут прояснить отдельные этапы эволюции генома.

Клонирование ДНК лимфоцитов человека было предпринято тоже для поиска повторяющихся последовательностей рДНК. К началу работы, проведенной в 1992-1993 гг. совместно с лабораторией академика А. А. Баева (ИМБ РАН), было известно, что кластер генов 5S рРНК человека локализован в хромосоме 1 и представлен двумя типами коротких повторов 2,2 и 2,6 т.п.н., их олигомерами из двух-четырех копий, а также протяженными участками (около 100 т.п.н.) с последовательностью рДНК. Для более детального изучения организации и полиморфизма кластера генов 5S рРНК нами был проведен скрининг 903 УАС-трансформантов, в результате которого были отобраны 12 клонов, давших положительный сигнал с зондом 5S рРНК. Субклонирование и рестриктный анализ ДНК восьми из этих клонов показали, что они содержат кластер повторов с размером повторяющегося элемента 6 т.п.н., в котором имеются три равных субэлемента, содержащих последовательность псевдогена 5S рРНК (400 п.н.). Промежутки между субэлементами различаются по наличию сайтов рестрикции. Эти данные подтвердили предположение о гетерогенности организации кластеров повторяющихся генов рДНК у человека. Полиморфизм может быть фактором, модулирующим экспрессию генов в составе кластера.

Познавательные статьи о генетике:

1) Факторы проявления Менделеевских законов

2) Наследование количественных признаков