Проект "Хромосома 19" и проблема химер PDF Печать E-mail

Проект "Хромосома 19" в рамках программы "Геном человека" предполагал осуществить картирование, секвенирование и изучение роли функционально-значимых некодирующих последовательностей. В дополнение к космидной и к ДНК клонотекам хромосомы 19 была создана частичная клонотека протяженных фрагментов ДНК в искусственных хромосомах дрожжей.

В качестве источника ДНК хромосомы 19 были использованы две линии гибридных соматических клеток (грызун-человек) GL12-42 (ИБХ РАН) и UU5HL-58 (LLNL, США), содержащие в качестве человеческого компонента только хромосому-19.
Скрининг клонотеки (более двух тысяч трансформантов) с помощью ин-тегративной селекции и методом гибридизации колоний in situ с зондами повторяющихся элементов ДНК человека показал, что УАС-клоны с ДНК человека составляют около 1%.
Клоны с фрагментами ДНК хромосомы 19 человека, использованные в нашей работе, были переданы для физического картирования и депонирования в банк данных в Национальную лабораторию Ливермора (США), с которой сотрудничал российский коллектив проекта "Хромосома 19".


Проблема химер


Коллекция нескольких тысяч YAC-клонов, содержащих фрагменты ДНК дрозофилы, лимфоцитов и хромосомы 19 человека, предоставила замечательную возможность использовать YAC в качестве модельной системы для исследования структурной и митотической стабильности искусственной хромосомы.
При анализе библиотек тотальной ДНК генома и хромосом-специфичных клонотек ДНК человека, созданных в начале 90-х годов, обнаружено от 20 до 50% химерных клонов, которые вносят артефакты в исследования нуклеотидной последовательности генома и при сопоставлении физических и генетических карт хромосом.

Механические разломы, одно- и двунитевые разрывы ДНК, а также лигирование плеч вектора более чем с одним фрагментом ДНК рестриктов из разных областей хромосомы могут приводить к образованию химерных YAC, которыми трансформируют сферопласты дрожжей. Для снижения вероятности таких событий in vitro процедуры с клонированной ДНК проводили в легкоплавкой агарозе, иммобилизуя молекулы ДНК. Доля химер уменьшается и при снижении концентрации клонируемой ДНК человека в лигирующей смеси. Сходный эффект "разведения" имеет место при создании УАС-клонотеки из клеток соматических гибридов, где доля ДНК человека составляет около 1%. В таких УАС-клонотеках доля химер не превышает 10%.
В последние годы была предложена новая технология получения клонов в составе YAC — метод трансформационно-ассоциированной рекомбинации. Метод исключает лигирование YAC in vitro и снижает тем самым вероятность образования химер. Детально метод описан ниже.

In vivo нестабильность структуры YAC возникает в процессе митотического деления дрожжей при рекомбинации повторов в ДНК YAC или гомологичных сайтов клонированной и природной ДНК дрожжей. Частота всех типов перестроек в ДНК YAC снижается в 5-8 раз при использовании в качестве реципиентов дрожжей с мутациями в генах, контролирующих репарацию/рекомбинацию.

Познавательные статьи о генетике:

1) Генетика для человека

2) Комплементарность