Структурные перестройки YAC PDF Печать E-mail

Успех применения YAC для любых молекулярно-генетических задач зависит от его структурной и митотической стабильности. Множество повторяющихся элементов в ДНК высших эукариот индуцирует процессы гомологичной рекомбинации в ДНК YAC, приводя к внутри- и межмолекулярным перестройкам клонированного фрагмента.

Перестройки структуры клонированного фрагмента ДНК YAC: делеции, инсерции, обмены — были количественно оценены нами в опытах с "маркированными" YAC. Методом ретрансформации в клонированную ДНК более двухсот YAC была встроена кассета Alu-HIS3-Alu. Анализ маркированных фенотипом 1-ц8-ретрансформантов показал, что в процессе ретрансформации и последующих митозов клетки происходит ряд генетических эффектов.
1. Интеграция кассеты Alu-HIS3-Alu происходит не только за счет го мологии Alu повторов в ДНК человека, но и вследствие гомологии гена HIS3 дрожжей в составе кассеты. Методом гибридизации ДНК Alu зонда с ДНК хромосом каждого из 60 случайно отобранных His+ ретрансформантов обнаружено, что у 6 из них HIS3 маркер локализуется не в УАС-последовательности. Два акта интеграции произошли в хромосому 15, где расположен HIS3 ген, остальные четыре в хромосомы 2, 4, 11, и 14 дрожжей.
2. Выборка из 121 маркированного YAC была использована для определения частоты делеций в УАС-последователыюсти при репликации и поддержании его в дрожжах. Контролем служили рУАС-векторы, не содержащие ДНК человека. Анализ не менее 50 субклонов каждого ретрансформанта (всего 6561) после 20-30 генераций выявил, что 239 субклонов, несущих YAC (4,5%), утратили HIS3 маркер. В контроле эта величина равна 0,06%. Таким образом, частота делеций кассеты Alu-HIS3-Alu в YAC с ДНК человека повышается на два порядка.
3. Нам удалось также количественно оценить частоту обменов между ДНК YAC и природных хромосом дрожжей: 5% ретрансформантов, утра тивших YAC во время инкубации, сохраняют Н18+-фенотип. Генетический анализ показал, что последовательность HIS3 обнаруживается как в районе локуса этого гена, так и в локусах других хромосом. Частота рекомбинационных событий составляет 102.

При определении размеров YAC всей клонотеки было обнаружено, что часть первичных трансформантов содержит не один, а несколько YAC (2-4), отличающихся по молекулярной массе. Этот факт отмечен в публикациях и других авторов, которые считали его следствием проникновения в клетку при трансформации нескольких рекомбинантных структур одновременно. Однако выявлена и другая причина: несколько YAC в одной клетке могут явиться результатом структурной перестройки одного и того же УАС-клона. Была прослежена судьба YAC в 6 линиях независимых трансформантов. Генетический анализ диплоидных гибридов этих линий после пятикратного последовательного скрещивания показал, что ни один из двух или более YAC не утрачивается при прохождении клеткой митоза и мейоза.

Все три генетических маркера YAC обнаруживают косегрегацию и менделевское наследование, т.е. проявляют свойства одиночной автономно-реплицирующейся структуры. Тот же вывод следует из результатов рестрикт-ного анализа и опытов по ДНК-ДНК-гибридизации в клетках постмейотических сегрегантов. Очевидно, в изученных линиях имеет место структурная нестабильность клонированного в YAC фрагмента ДНК, при которой только определенные перестройки жизнеспособны и поддерживаются клеткой. Эти результаты количественно подтверждают данные других авторов об актах рекомбинации, как источнике химерных YAC.

Таким образом, сочетание методов молекулярной биологии и классической генетики при анализе УАС-клонотек, содержащих ДНК из разных источников, дало возможность количественно оценить вероятность нарушения аутентичности клонированной ДНК.

 

Познавательные статьи о генетике:

1) Влияние мутаций SRM на стабильность хромосом

2) Влияние мутаций srm на митотическую стабильность рекомбинантных плазмид