Клонирование в YAC методом трансформационно-ассоциированной рекомбинации PDF Печать E-mail

В рамках проекта "Хромосома 19" в лаборатории, руководимой академиком Е. Д. Свердловым (ИБХ РАН), детально изучены последовательности длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов человека семейства К (LTR HERV-K) хромосом 19,21 и 22 человека, для которых определены первичная структура этих элементов и фланкирующей их геномной ДНК, локализация на физической карте, систематика, эволюционный возраст и предполагаемые регуляторные функции.

Анализ распределения копий LTR по всему геному свидетельствует о том, что некоторые хромосомы, в том числе 19-я, обогащены LTR, а другие содержат умеренное или малое число их копий. Для определения функциональной активности, специфичности распределения и времени интеграции в геном LTR HERV-K необходим сравнительный анализ этих последовательностей в разных хромосомах. В связи с этим в качестве еще одного объекта исследования авторских коллективов в РФ и ФРГ (Филиппе Университет Марбурга) в 1997 г. была выбрана хромосома 7.

Для конструирования клонотеки нам была передана проф. К.-Х. Гржешиком (ФРГ) линия гибридных соматических клеток RuRag 14-4-7-44, где хромосома 7 представлена малым плечом со своей теломерой и другой теломерой, близко сцепленной с центромерой, а геном мыши — гетероплоидным набором хромосом, близким к 4п. Менее 10% клеток линии RuRag 14-4-7-44 после размножения культуры имеют малое плечо 7 хромосомы. Исходя из размеров генома мыши и 7р хромосомы следовало ожидать, что не более 1 из 2000 полученных УАС-трансформантов будут содержать ДНК человека при рутинном методе клонирования.

С целью сохранения аутентичности ДНК человека в YAC и повышения эффективности проводимой работы нами был применен альтернативный подход клонирования — метод трансформационно-ассоциированной рекомбинации. Искусственная хромосома дрожжей с клонированным фрагментом гетерологичной ДНК "конструируется" in vivo за счет сопутствующих процессу котрансформации актов гомологичной рекомбинации между повторяющимися элементами ДНК человека (например Alu) и теми же повторами, включенными в состав вектора. В результате селективное клонирование ДНК человека происходит внутриклеточно на стадии возникновения трансформантов. Преимуществами метода являются практически полное отсутствие химерных фрагментов клонированной ДНК человека и многократное обогащение клонами ДНК человека при создании библиотеки из ДНК клеток монохромосомных соматических гибридов грызун/человек.

В опытах по клонированию TAR-методом использованы векторы, которые образуют в процессе трансформации линейные и кольцевые YAC. Характерной особенностью TAR-векторов является отсутствие ARS-последовательности, обеспечивающей репликацию YAC в дрожжах. Известно, что в геноме человека ARS-подобные последовательности расположены достаточно часто, в среднем 1 на 30-40 т.п.н. Следовательно, протяженные фрагменты ДНК человека, клонированные в YAC, могут с большой вероятностью содержать ARS-структуры, способные реплицироваться в дрожжах. Использование векторов, лишенных дрожжевого ARS, обеспечивает дополнительный механизм селекции.

Познавательные статьи о генетике:

1) Роль искусственных хромосом дрожжей в изучении генома человека

2) Структурные перестройки YAC