Отбор и анализ YAC клонов с ДНК человека PDF Печать E-mail

Методом TAR-клонирования было получено 1806 первичных трансформантов. Многоступенчатый скрининг, включающий генетическую селекцию, гибридизацию колоний in situ с меченой тотальной ДНК человека и inter-Alu-PCR, показал, что 76 из них содержат вставку ДНК человека. Поскольку тотальная ДНК клеток соматического гибрида содержит 0.05% ДНК человека, а выход клонов 7р среди TAR трансформантов составил 4,2%, что на два порядка выше, очевидно, что избранный метод TAR-клонирования оказался примерно в 100 раз эффективнее традиционного.

Размер клонированных фрагментов составил от 100 до 900 т.п.н. Анализ inter-Alu PCR продуктов показал отсутствие перекрытий вставок, что свидетельствует о случайном распределении клонов по хромосоме. Исходя из размеров и количества УАС-клонов, библиотека содержит суммарно около 12 млн п.н., что составляет 20% короткого плеча хромосомы 7. Субтеломерные области хромосом человека содержат ARS-последовательности (Flint et al., 1997), этот факт мог бы повысить вероятность клонирования концов хромосом TAR-вектором, не содержащим ARS дрожжей.

Изучение концов хромосом является необходимым этапом в определении границ физической и генетической карт хромосом любых геномов. Клонирование концов хромосом представляло определенные сложности и первые фаговые и космидные библиотеки практически не содержали теломерных последовательностей. Применение метода "полу-УАС" для клонирования концов хромосом весьма трудоемко. В этой работе лишь один YAC из 600 "полу-УАС" клонов был строго локализован в области теломеры 7q. В более поздней работе для отбора 40 YAC клонов, представляющих 31 конец хромосом, пришлось анализировать 12 000 первичных трансформантов.

Поиск терминальной последовательности короткого плеча хромосомы 7 человека в ДНК УАС-клонов проведен нами методом ПЦР с парой прай-меров (D1 и D2), которые образуют ПЦР-продукт размером 246 п.н. при амплификации ДНК соматического гибрида с коротким плечом хромосомы 7, и не образуют продукта с ДНК дрожжей, мыши и соматического гибрида, содержащего 7q. Четыре УАС-клона, позитивных в реакции с D1-D2, локализованы в 7р21, 7р15.1-7р15.3, 7р15.1-7р15.2, 7р15.1-7р15.2 областях хромосомы 7 методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с метафазными хромосомами человека продуктов Alu-PCR ДНК УАС-клонов. Следовательно, эти клоны не являются фрагментами теломеры 7р, а лишь содержат гомологичные последовательности, которые выполняют функцию теломерных концов в YAC. Этот тип YAC составлял основной генетический шум, на фоне которого велся поиск клонированных терминальных последовательностей человека во всех работах с векторами, имеющими только одну теломеру.

Механизм образования структуры, функционирующей на конце искусственной хромосомы дрожжей, мало изучен. Известно, что такие последовательности часто встречаются в геноме эукариот и локализуются, в частности, у человека в разных, нетерминальных сегментах хромосом. Такие концы обладают структурной нестабильностью: в процессе репликации и размножения клонированный фрагмент может существенно укорачиваться. После нескольких пассажей наряду с линиями клеток, несущих первичный YAC, нами обнаружены линии с YAC меньшего размера. Подобные факты отмечены и в других работах.

Для более направленного поиска теломерных и субтеломерных клонов мы использовали 5 пар STS праймеров в качестве тестов на последовательности, расположенные на разном расстоянии от теломеры хромосомы 7р (до 300 т.п.н). ПЦР продукты были обнаружены с тремя последовательно расположенными праймерами в ДНК YAC 24-17. Следовательно, этот YAC содержит терминальный фрагмент короткого плеча 7 хромосомы. Локализация клона YAC 24-17 на терминальном участке 7р хромосомы подтверждена методом FISH. ДНК данного клона гибридизуется также с несколькими, преимущественно терминальными, районами других хромосом: 7cen; lpter; Iq41; 5qter; 16qter; 16pter. Множественная гибридизация подтверждает данные о том, что терминальные области разных хромосом обладают сходной структурой и богаты консервативными повторами. Итак, в клонотеке хромосомы 7р, размером 12 млн.п.н, удалось клонировать терминальную последовательность этой хромосомы. Успех клонирования концевой области с ARS-последовательностью обусловлен, возможно, применением TAR векторов, не содержащих области начала репликации.

В агентстве недвижимости sevarenda вы можете взять в аренду любой вид жилья начиная с однокомнатной квартиры заканчивая частным домом.

Познавательные статьи о генетике:

1) Половой хроматин

2) Сцепленные признаки